安捷伦高效液相色谱1260 II——操作规程

• 仪器型号：Agilent 1260 II

• 仪器厂商：美国Agilent

• 启用日期：2019年5月市政与环境工程学院安装启用

1. 仪器组成

1.1 仪器各部件名称

Agilent 1260 II 各部件名称如下：

1260 Infinity II 样品瓶进样器

1260 Infinity II柱温箱

1260 Infinity 脱气机

1260 Infinity II 四元泵

1260 Infinity II 二极管阵列检测器

1260 Infinity II 荧光检测器光谱

数据采集和处理系统

1.2 仪器各部件性能

1.1.1 1260 Infinity II 样品瓶进样器

1260 Infinity II 样品瓶进样器将样品管理和色谱柱操作结合到单个自动进样器模块中。样品瓶进样器可以从多达 132 个标准 2 mL 样品瓶中进样，额定压力为 600 bar 或 800 bar。可定制的进样程序，用于高级进样序列或进样前的样品前处理。

1.1.2 1260 Infinity II柱温箱

能够在宽温度范围内提供精确的温度控制，可冷却至环境温度以下 20 °C，并加热至 110 °C。

1.1.3 1260 Infinity脱气机

1260 Infinity 高性能脱气机专为最高流速为 5 mL/min 的低流量和分析型液相色谱设计，可降低基线噪音和淬灭效应。

1.1.4 1260 Infinity II 四元泵

1260 Infinity II 四元泵是一种梯度泵，使用低压混合，实现最多四种溶剂的 UHPLC 梯度形成和溶剂混合。该泵在最高 600 bar 的压力下运行，且流速高达 10 mL/min。高达 10 mL/min 的宽流速范围支持标准的分析型和半制备型应用，是 4.6 mm 和 3.0 mm 内径色谱柱的理想选择最大压力为 600 bar，允许使用粒径更小的色谱柱、柱长更长的色谱柱和/或用粘性更高的溶剂来代替乙腈，以实现更高的分离度和/或更快的分离速度。

轻松操控多达 4 种溶剂用于等度或梯度分析，加快方法开发、流动相配制和系统冲洗的速度轻松、快速、安全地将方法从传统色谱柱转移至亚 2 微米色谱柱基于 PTFE AF 技术的低内容积高效集成式脱气机可以为吹扫和灌注提供快速的溶剂切换耐用的材料（不锈钢、钛、金、红宝石、蓝宝石、陶瓷、PEEK 和 PTFE）适用于最严苛的应用，在降低运行成本的同时可延长泵使用寿命。

1.1.5 1260 Infinity II DAD检测器

1260 Infinity II DAD检测器可实现多波长和全谱检测，即使在高数据采集速率下，也能对痕量化合物进行精确的鉴定、定量和峰纯度分析。120 Hz 的全谱数据采集速率可提高分离度，能在痕量水平下实现快速、高灵敏度的峰纯度分析和谱图确认双灯设计能够在 190-950 nm 的波长范围内进行分析。

1.1.6 1260 Infinity II 荧光检测器光谱

1260 Infinity II 荧光检测器光谱是一款高灵敏度 HPLC 荧光检测器，可通过一次运行同时提供定量数据和荧光光谱，能够快速优化 HPLC FLD 检测器光谱实验方法。使用在线光谱信息实现快速方法优化并验证分离质量。高速检测采用高达 148 Hz 的数据采集速率，适用于非常窄的峰。

2.操作规程

2.1开机

1.把经过滤、脱气的各流动相装入贮液瓶中。

2.打开计算机，打开主机各模块电源(从上至下)，再双击桌面.“LC1260(联机)”图标，进入化学工作站。

3.旋开排气阀(逆时针)，右键单击“四元泵”图标出现快捷键，点击“方法”选项进入泵编辑画面。将泵流量设为“5mL/min”，溶剂A设为“100%”，打开泵，排出管路中的气体，直到由贮液瓶到泵入口整个管路中无气泡为止，此过程约需要5min。

4.依次切换到溶剂B、C、D，分别排气。

2.2数据采集

1. 编辑样品信息:由“运行控制”进入“样品信息”，设定操作者姓名，样品数据文件名等。

2.编辑完整方法:从“方法”菜单中选择“编辑完整方法”项，单击“确定”进入“方法注释”，编辑好单击“确定”。在“选择进样源”中选择“手动进样”单击“确定”，在“设置方法”中进行参数设定。

3.四元泵参数设定：在“流速”处输入流量，如1mI /min，在“溶剂”处依据需要选中B、C、D并输入相应的百分数，在右侧注释栏中标明各溶剂的名称;设置“停止时间”和“后运行时间”,在“压力限值”处输入柱子的最大耐高压以保护柱子，在“时间表”添加编辑梯度。

4. 柱温箱参数设定:在“温度”左侧下面的方框内输入.所需温度,并选中它,右侧选中“与左侧相同”，使柱箱的温度左右一致。

5. DAD检测器参数设定:在“波长”右侧的空白处输入所需的 检测波长，在“峰宽(响应时间)”下方点击 下拉式三角框，选择合适的响应时间，再设置“停止时间”和“后运行时间”。

参比波长：参比波长建议勾选，可以减小梯度洗脱过程中环境温度波动或折射率变化造成的基线漂移和波动。参比波长应设在样品没有吸收的地方，且越靠近样品的检测波长越好。另外，要求参比带宽>=样品带宽>=狭缝宽度。

光谱：窗口规定的是采集光谱时的参数。可保存所需张数的光谱图“无”或“全部”。若需要进行峰纯度检测或优化完全未知的样品检测条件，建议选择“全部”的模式。

6．FLD（荧光检测器）：一般来说，使用荧光检测器时，按照法规或方法的要求输入的激发波长和发射波长即可。

多波长：需要进行多波长检测时，在高级选项中多波长界面下，根据需求的多激发波长或多发射波长模式，即可在一次进样中最多同时获得四张检测条件不同的色普图。

7.仪器曲线设置:默认即可。

8.关闭排气阀(顺时针)，冲洗色谱柱20~30min， 待柱前压力基本稳定后，打开检测器灯，观察基线情况。

2.3数据处理

1.在桌面上单击“LC1260(脱机)”进入数据分析界面。

2.从“文件”菜单选择“调用信号”选中您的数据文件名，单击“确定”

3.谱图优化，从“图形”菜单中选择“信号选项”，从“范围”中选择“自动量程”及合适的显示时间单击“确定”,或选择“自定义量程”调整，反复进行直到图的比例合适为止。

4.积分:从“积分”中选择“自动积分”,积分结果不理想，再从菜单中选“积分事件”选项，选择合适的“斜率灵敏度，峰宽，最小峰面积，最小峰高”。从“积分”菜单中选择“积分”选项则数据.被积分，如积分结果不理想则修改相应的积分参数直到满意为止。单击左边图标将积分参数存入方法。

5.校正表设计：点击“校正”菜单中的“校正设置”，给出各个参数，点击“确定”;调出建立校正表所需的谱图并对谱图进行图形.优化和积分优化；点击“校正”菜单中的“新建校正表”，在“新建校正表”栏里选定“自动设定”点击“确定”；在“校正表”中给出正确的“化合物名”和“含量”；如需增加校正点数，给出第二校正点的“含量”，校正表建立完成后点击“确定”，点击“保存图标”将校正表存入方法中。

6.打印报告：从“报告”菜单中选择“设定报告”选项进入画面，单击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角选中所需定量方法，其它选项不变，单击“确定”，从“报告”菜单中选择“打印”则报告结果将打印到屏幕上,如想输出到打印机上则勾选“报告”中的“输出至打印机”。

2.4关机

1.关机前，用95%水冲洗柱子和系统0.5~1h，流量0.5~ lmL/min，再用100%有机溶剂冲洗0.5h，然后关泵。

2.退出化学工作站及其它窗口，关闭各模块电源，关闭计算机。

3.使用注意事项

3.1日常维护

项目内容贮液器保持贮液瓶清洁，定期清洗;尽量使用HPLC级溶剂和试剂;流动相使用前定要用合适的滤膜过滤;含有缓冲盐的流动相应现配现用。

泵

仪器使用完毕应立即将泵中的缓冲盐冲洗干净;定期清洗过滤筛板，1molL硝酸浸泡1h，,再用纯水清洗干净。

进样器样品进样前要过滤。进样针可定期清洗。色谱柱新柱或长期不用的色谱柱使用前要用适宜的溶剂在低流量下0.2~0.3mL/min)冲洗30min;使用缓冲盐后要先用5%甲醇水溶液冲洗再用有机溶剂冲洗;仪器工作完成后要立即冲洗柱子和管线;建议使用保护柱;应避免流动相组成和极性以及压力脉冲的剧烈变化。检测器保持检测器清洁、干燥;检测器灯不用时不要打开，也不要频繁开关;不要用手直接接触氘灯表面。

3.2注意事项

1.开机后，打开排气阀，依次将所需溶剂设为100%， 泵流量5mL/min，若此时显示压力大于10bar，则应清洗过滤白头。

2.流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的超纯水（易长菌）。