高效液相色谱

安捷伦1260操作规程

一. 简介

• 仪器型号：Agilent 1260 HPLC高效液相色谱

• 仪器厂商：美国安捷伦公司

• 仪器性能： 流速范围：0.001~5.0mL/min, 0.001mL/min步进；压力范围： 0-40MPa(0-400bar,0-5880psi)；梯度组成精密度：<0 .15%sd（1ml/min）。

• 可测项目：可用于痕量分析，其检测限为ppb～ppm级。

• 样品要求：样品一般需预处理。

每个新来的同学，请先在D盘建立自己的文件夹，文件夹里再包括方法、数据和序列三个子文件夹，并在view-preferences里增加自己的路径。

二、实验步骤

开 机

1) 将待测样品按要求前处理，准备HPLC所需流动相，检查线路是否连接完好，废液瓶是否够用等。

2) 开机。打开电脑、HPLC各组件电源。

3) 打开软件（联机），配置仪器 （配置1260系统模块，根据需要配置，检测器选择如VWD或DAD）

4) 打开工作界面，按操作要求赶流动相气泡。（排气：逆时针旋松“Purge”阀，软件上点击“Pump”图标，点击“Setup pump”选项，进入泵编辑画面，设Flow：5mL/min，点击“OK”。 点击“ Pump ”图标，点击“Pump control”选项，选中“On”，点击“OK”，则系统开始Purge，要求赶10min，到无气泡为止。切换通道（A-B-C-D）继续Purge，直到所有要用通道无气泡为止。点击“Pump”图标，点击“Setup pump”选项，设Flow：1.0或1.5mL/min。点击“Pump”图标，点击“Pump Control”选项，选中“Off”，点击“Ok”关泵，顺时针拧紧Purge valve。）

5) 建立清洗、平衡柱子分析方法（这步也可在脱机软件上完成），保存并运行。

编辑方法及样品分析

1) 方法信息：从“Method”菜单中选择“Edit entire method” 项，选中除“Dataanalysis ”外的三项，点击“Ok”，进入下一画面。在“Method Comments”中写入方法的信息。点击“Ok” 进入下一画面。（联机或脱机情况下，可以直接编辑方法所需的模块，然后方法另存为...）

2) 自动进样器参数设定：选择合适的进样方式, “Standard Injection”----只能输入进样体积，此方式无洗针功能。“Injection with Needle Wash”----可以输入进样体积和洗瓶位置，此方式针从样品瓶抽完样品后，会在洗瓶中洗针。“Use injectorprogram”---可以点击“Edit ”键进行进样程序编辑。点击“Ok”进入下一画面。

3) 泵参数设定：（以四元泵为例）在“Flow”处输入流量，如1.5ml/min，“Solvent B”处输入70，(A=100-B-C-D) ，可Insert 一行”Timetable”，编辑梯度。在“Pressure LimitsMax”处输入柱子的最大耐高压，以保护柱子。点击“Ok”进入下一画面。

4) 柱温箱参数设定：在”Temperature”下面的空白方框内输入所需温度，并选中它，点more查看，保证左右两边柱温箱温度一致。

5) VWD检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。

6) DAD检测器参数设定：检测波长：一般选择最大吸收处的波长。样品带宽BW： 一般选择最大吸收值一半处的整个宽度。参比波长：一般选择在靠近样品信号的无吸收或低吸收区域 。参比带宽BW：至少要与样品信号的带宽相等，许多情况下用100nm作为缺省值。Peak width（Response time）：其值尽可能接近要测的窄峰峰宽。Slit-狭缝窄，光谱分辨率高；宽时，噪音低。同时可以输入采集光谱方式，步长，范围，阈值。

7) FLD检测器参数设定: Excitation A: 激发波长:200-700nm，步长为1nm，或Zero Order。Emission: 发射波长: 280-900nm，步长为1nm，或Zero Order。同时可以输入范围Range、步长step、采集光谱。

（联机或脱机情况下，可以直接编辑方法所需的以上各模块，然后方法另存为...）

8) 新建序列：在菜单中点击新建序列，在序列参数中输入样品信息，在序列表中输入样品位置，方法等，保存序列。

9) 序列参数设置：设置数据储存路径

（单个进样适合用来摸索方法，在菜单中点击单个进样，在样品信息中设置数据储存路径，样品位置，样品名称等。单个进样使用当前方法）

10) 运行序列：等仪器显示ready，可运行已建好的序列或单个样品进样。

数据分析

1) 从“View”菜单中，点击“Data analysis”进入数据分析画面。

2) 从“File”菜单选择“Load signal”， 选中您的数据文件名， 则数据被调出。

3) 从“Integration”菜单中选择“Integration Events”选项。选择合适的“Slope sensitivity”，“Peak width”，“Area reject”，“Height reject”。

4) 从“Integration”菜单中选择“Integrate”选项， 则数据被积分。

5) 如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

关 机

1) 样品分析结束后，调用清洗柱子的方法，清洗柱子和系统。

2) 关机前，先关灯，用相应的溶剂充分冲洗系统。

3) 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机（用shut down关）。

4) 关闭Agilent 1200各模块电源开关。

三、Agilent 1260 LC维护保养和注意事项：

1.登记：仪器使用前必须登记，使用过程中遇问题要注明并及时和负责仪器的老师反馈

2.废液桶：使用前检查废液桶情况，避免废液过多漏出

3.流动相：1）流动相要经常更换，特别水相，水相上机前要抽滤，避免堵塞仪器

2）测试完收好流动相，将样品瓶和色谱柱（自己组的）带走

4.色谱柱：上色谱柱时要一边稳定进样管（铁丝），一边旋转进样盖（塑料），避免色谱柱进样针断裂

5.仪器保护液：安装流动相时，取下仪器保护液，并从抽屉里取出盖子盖上（防止保护液挥发、落灰尘），测样结束后带走自己组的流动相的同时，重新装上仪器保护液（进样头浸入液面下），并将盖子放抽屉里

6.仪器运行时长：如果仪器过夜测样，必须设置stop指令，并于次日清晨尽早来关闭仪器，绝对不允许仪器长时间运行而人不在（特别是测样结束后未关闭状态的空运行）

7.桌面整洁：测样时带来的东西，测样结束后全部带走，特别是不允许留下废纸、用过的手套和样品瓶